Karakterisasi dan Konstruksi Vektor Ekspresi Gen Small Heat Shock Protein (Shsp) Lactobacillus plantarum Sebagai Alternatif Penanda Seleksi Food Grade di Lactococcus lactis : Tesis

Foto-Haslia MargaretaBakteri asam laktat dikenal dengan bakteri yang memiliki status Generallly Recogninize As Safe (GRAS) yaitu mikroba yang aman dan tidak beresiko terhadap kesehatan. BAL umumnya digunakan pada industri fermentasi makanan. Lactobacillus plantarum U10 adalah salah satu BAL yang telah diisolasi dari makanan fermentasi tradisional Indonesia, yaitu Tempoyak.

BAL mempunyai sifat yang sensitif terhadap kondisi lingkungan, ketika digunakan sebagai starter komersial atau ketika produk fermentasi sedang diproses, diangkut dan disimpan. Strategi yang digunakan untuk meningkatkan ketahanan BAL terhadap tekanan lingkungan adalah dengan mengembangkan food grade vector dengan marka seleksi gen small Heat Shock Protein (sHSP). Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen small Heat Shock Protein (sHSP) asal L. plantarum U10 yang diisolasi dari makanan tradisional Indonesia “Tempoyak”. Selain itu penelitian ini juga bertujuan untuk mengklon promotor slpA dan gen sHSP ke dalam vektor kloning pGEM-T dan konstruksi gen fusi antara promotor slpA dan gen sHSP ke dalam vektor ekspresi pNZ8148, serta mengintroduksikannya ke dalam strain BAL jenis L. lactis NZ3900. Penelitian ini terdiri dari tiga tahapan, yaitu karakterisasi, kloning dan konstruksi. karakterisasi dimulai dengan perlakuan kejut panas pada L. plantarum U10 dan SDSPAGE. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas Chaperon, isolasi total RNA dan analisis Reverse Transcriptase PCR. Tahapan kloning dimulai dari amplifikasi gen sHSP dari DNA kromosom L. plantarum U10 dan promotor slpA dari isolat L. acidophilus C9-9, kemudian mengkloningnya ke dalam vektor kloning pGEM-Teasy. Selanjutnya vektor kloning pGEM-T slpA digunakan sebagai sumber untuk memperoleh promotor slpA dan pGEM-T sHSP sebagai sumber untuk gen sHSP. Konstruksi vektor food grade dilakukan dengan memfusikan promotor dan gen terlebih dahulu. Fusi keduanya dilakukan dengan teknik PCR overlapping sehingga menghasilkan fusi antara promotor slpA dan gen sHSP. Fusi dipotong dengan menggunakan enzim restriksi SalI-BglII. Vektor ekspresi pNZ8148 juga dipotong dengan enzim yang sama pada daerah kloramfenikol, dan kemudian diligasikan dengan fusi slpA-sHSP.

Tahapan terakhir adalah mengintroduksikan hasil ligasi ke inang L. lactis NZ3900 menggunakan teknik elektroporasi, dan dilakukan konfirmasi dengan PCR Koloni. Karakterisasi dari small Heat Shock Protein (sHSP) dari isolat Lactobacillus Plantarum yang diisolasi dari Tempoyak telah diteliti. Protein yang berhubungan dengan respon panas memiliki ukuran yang bervariasi antara 18-51 kDa. Fraksi IntraselularProtein (IP) dari kejut panas L. plantarum U10 menunjukkan aktivitas chaperon dibuktikan dengan kemampuan untuk mencegah hilangnya aktivitas proteinase K dari denaturasi. Selain itu, gen sHSP berhasil di identifikasi dengan metode PCR dengan ukuran 423 pb. Protein sHSP dengan ukuran ±18 kDa karena peningkatan regulasi setelah L.plantarum U10 diberi perlakuan tekanan panas yang dibuktikan dengan Reverse Transcriptase-PCR.

Hasil ini menunjukkan bahwa protein sHSP ±18 kDa pada penelitian ini dapat mempertahankan kelangsungan hidup L. plantarum dan mampu melindungi sel terhadap tekanan suhu. Fragmen promotor slpA berukuran 192 pb berhasil teramplifikasi dari L.acidhopilus C9-9. Fragmen gen sHSP berukuran 423 pb berhasil teramplifikasi dari kromosom L. plantarum U10. Hasil analisis sekuen menunjukkan bahwa promotor slpA memiliki tingkat kemiripan mendekati 100% dengan L. acidophilus ATCC 4356 referensi. Analisis sekuen gen sHSP juga menunjukkan tingkat kemiripan tinggi 100% dengan L.plantarum WCFS1 referensi. Fusi antara promotor slpA dan gen sHSP berhasil termplifikasi dengan ukuran 615 pb dengan teknik PCR overlapping. Fusi gen tersebut berhasil dimasukkan ke dalam vektor ekspresi dengan mengganti bagian kloramfenikol yang telah dipotong terlebih dahulu dengan enzim restriksi yang sama yaitu SalI dan BglII sehingga terbentuk pNZ8148-slpA-sHSP dan diintroduksikan ke inang L. lactis NZ3900. Konfirmasi vektor rekombinan dilakukan dengan PCR koloni dengan penggunakan primer dari gen fusi slpA dan sHSP dan PCR koloni dengan menggunakan primer promotor dan terminator pNZ8148. (Haslia Margareta, pembimbing : Utut Widyastuti dan Apon Zaenal Mustopa)

  

Katalog : http://perpus.biotek.lipi.go.id/index.php?p=show_detail&id=15361&keywords=Haslia+Margareta
 
 
Pustakawan : Siti Elly Faisholyah.